1. Resumé
Genom editering er en relativt ny teknologi med enorme perspektiver, både forskningsmæssigt, klinisk til afklaring af den funktionelle betydning af genetiske varianter samt produktionsteknisk for bioindustrien. Genom editering (Bhaya 2011, Chandrakasan 2014, Guilinger 2014) er en teknologi hvor det er muligt at ændre en eller flere baser i DNA i en levende celle til en anden næsten vilkårligt valgt base eller en DNA sekvens.
Nye sammenhænge mellem genetiske varianter og sygdomme bliver med stadigt stigende hastighed klarlagt, men der er stadig meget vi ikke ved. Viden om sammenhængen mellem genetiske varianter og sygdom eller sygdomsdisposition danner grundlag for genetisk diagnostik og prognose , og åbner mulighed for evt forebyggende intervention. Genom editering vil i denne sammenhæng blive et vigtigt redskab i laboratoriet til med sikkerhed at fastslå en sammenhæng mellem et genetisk fund og en funktionel effekt af dette genetiske fund, idet man kan korrigere den fundne genetisk variant i en passende celletype in vitro og herefter teste den korrigerede celletype og vurdere effekten. Kan man in vitro påvise at have fjernet den sygdomsvoldende effekt i den korrigerede celle er dette et stærkt mulige bevis for en kausalitet. På sigt kan teknologien anvendes til at helbrede genetisk sygdom hos det enkelte menneske f.eks. ved udelukkende at ændre en skadelig genetisk variant i en patients knoglemarvsstamcelle til en genetisk variant som ikke er sygdomsvoldende og derefter give den korrigerede, normale knoglemarvsstamcelle tilbage til patienten som herefter er helbredt. Teknologien har også potentiale til at udskifte en sygdomsvoldende genetisk variant i en befrugtet ægcelle med en ikke-sygdomsvoldende variant og dermed sikre at barnet ikke får den pågældende sygdom og at sygdommen ikke videreføres til kommende generationer.
Genom editerings teknologi kan tillige anvendes på både dyr og planter samt celler som i industrien bruges til fremstilling af bioteknologiske produkter og har således også store direkte produktions tekniske perspektiver genom editerings teknologi kan baseres på flere forskellige teknologier, men især den såkaldte CRISPR teknologi (Wiedenheft 2012) har påkaldt sig stor international interesse. Det er første gang i menneskehedens historie at en sådan teknologi er til rådighed. Det er vigtigt at man i Danmark har fokus på dette teknologiske område som udover højtuddannede mennesker også kræver samarbejde på tværs af flere fagområder for at give størst muligt gavnlig effekt. Denne teknologiske udvikling er først og fremmest foregået i USA, men udviklingen vil også komme til Europa. En fremsynet strategi og konkret plan for anvendelse af denne teknologi i Danmark vil komme os alle til gode.
2. Samfundsudfordringer og/eller muligheder
Som det er set før fx med in vitro fertilisation og rekombinant DNA teknologi, hersker en vis teknologi frygt i den danske befolkning, men den teknologiske udvikling indenfor genom editerings området skrider frem meget hurtigt, det er kun et spørgsmål om vi ønsker at gå med i denne udvikling med kæmpemæssige perspektiver og drage fordel af forskningsmæssige, industrielle og samfundsmæssige perspektiver. Det vil være at et bredt udsnit af højtuddannede personer behersker og anvender denne teknologi.
Uddannelse i gymnasiet og generel udbredelse af viden i samfundet vil være nyttig for at skabe større accept af disse vigtige teknologier.
Etisk råd har udtalt sig om genom editerings teknologien hvor et mindretal har afgivet dissens og udtalt sig positivt om teknologien og dens muligheder (1). De myndigheder som regulerer rekombinant DNA arbejde og lægemidler dvs Arbejdstilsynet og lægemiddelstyrelsen bør have den nødvendige viden for bedst at kunne godkende projekter og senere kliniske behandlinger med genom editering. For nyligt har en række kendte biologer foreslået moratorium vedr genom editering på germ line niveau (Baltimore 2015). CRISPR genom editerings teknologien er blevet kaldt “The Biggest Biotech Discovery of the Century” i MIT Technology Review.
Fig 1 viser teknologien skitseret:
Flere firmaer er i de seneste år blevet grundlagt med genom editering som fokus område fx Editas Medicine, Caribou Biosciences, Inc., CRISPR Therapeutics, Precision BioSciences, Sangamo (bruger ZFN). Øget anvendelse af genom editering kan opnås ved målrettede bevillinger til området.
Selvom de enkelte genetiske sygdomme er relativt sjældne, findes samlet set mange mennesker i Danmark med en genetisk betinget manifest sygdom. Det er anslået at der er ca 30-50.000 mennesker i Danmark der lider af en sjælden sygdom hvoraf mange er genetisk betingede. Der kan p.t. undersøges for omkring 2000 forskellige genetiske sygdomme. Et perspektiv ved genom editering er mulighed for på sigt at helbrede tidligere uhelbredelige sygdomme således, at der ikke længere er behov for kontinuerlig medicin. Der er endvidere store perspektiver indenfor bioteknologien generelt til forbedrede produktionsformål og forskningsformål.
Genom editerings teknologien åbner for første gang realistisk mulighed for effektiv behandling af genetiske sygdomme og afhjælpning af enorme lidelser for det enkelte menneske og samfundsmæssige udgifter. Dette vil i første omgang formentlig ske på knoglemarvsstamceller og senere vil teknologien med udviklede transfektionsteknologier blive anvendt på andre væv; dette er allerede sket i dyremodeller (Yin 2014). En afgørende fordel ved genom editering er at der ikke efterlades ”spor” i genomet: kun den ønskede ændring forbliver i det editerede genom. Der kan dog opstå den såkaldte off target effekt (Ran 2013a, Suzuki 2014) med utilsigtede ændringer andre steder i genomet, men dette problem forventes at blive negligeabelt med stadig bedre genom editerings metodik (Tsai 2014). Andre tilgange til behandling af genetiske sygdomme fx ved behandling af hæmofili sker ved genterapi med overførsel af et normalt gen for factor IX via AAV (adenovirus associeret virus) transformation og denne behandling synes at fjerne behov for stadige infusioner af bløderpræparater. Denne type genterapi er dog forbundet med visse ulemper.
Fig 2 viser udviklingen af videnskabelige publikationer indenfor CRISPR baseret genomeditering.
3. Forskningsbehov
Der vil være behov for at skabe et større segment indenfor dansk bioforskning hvor genom editering anvendes. Specifikt vil udvikling af teknologier til anvendelse af genom editering i alle væv, med høj effektivitet være en prioritet. Yderligere nedbringelse af off target effekt, metoder til måling af off target effekt er først og fremmest DNA sekventering. Dette vil formentlig blive et krav ved klinisk anvendelse af genom editering. På sigt vil utvivlsomt blive udviklet teknologi til effektiv genom editering på zygote niveau.
4. Udmøntning
Bidrage til genetisk forskning generelt, muligøre produktion af isogene kontroller til celle assays baserede analyser, bedre produktions metoder i bioindustrien, applikation indenfor veterinærområdet og fytopatologi. Efter omhyggelige in vitro studier (Genovese 2014) vil på sigt klinisk-terapeutisk anvendelse ved genetiske sygdomme komme på tale, i første omgang sandsynligvis genetiske sygdomme, der kan helbredes ved genom editering af knoglemarvsstamceller. Inspireret af bl. a. (Xie 2014) har vi en konkret model til validering af genetiske fund gjort ved exom analyse:
Fremgangsmåde falder naturligt i 4 dele:
- Design og konstruktion af gRNA til genomeditering.
- Test af CRISPR systemet på fibroblast cellelinie fra patient.
- Genom-editering af CD34+ stamcelle og test af effektivitet med Surveyer kit.
- In vitro production af erytrocytter ud fra genom-editerede stamceller og funktionel karakterisering af oprindelig fænotype og af editeret fænotype.
Hvis de editerede stamceller giver anledning til normal produktion af normale erytrocytter og de ikke-editerede stamceller ikke giver anledning til normal produktion af normale erytrocytter, har man stærk evidens for at de genetiske fund fra exom analysen korrekt har identificeret de genetiske varianter, som er årsag til sygdommen.
På sigt efter godtgørelse af metodens sikkerhed og opnåelse af de nødvendige myndighedstilladelser vil der således være teknisk mulighed for klinisk anvendelse af denne teknologi.
5. Danske forudsætninger
Danmark har en stærk bioteknologisk baseret industri og en række højt uddannede forskere ved de højere læreanstalter. En række steder er man begyndt at arbejde med genom editerings teknologien inkl i industrien. Danmark har således særdeles gode forudsætninger for implementering af denne teknologi.
6. Målsætninger og perspektiver
Overordnede mål er at etablere et stærkt forskningsmiljø i Danmark med netværk hvor forskellige forskergrupper kan samarbejde.
Generelt at støtte forskning og anvendelse af genom editering til etablering af funktionelle sammenhænge, senere klinisk behandling af mennesker. Dette sidste kan ske i samarbejde med det klinisk immunologiske speciale, der råder over både stamcelle faciliteter og erfaring med GMP fremstillede produkter.
Applikation inden for bioindustrien, il industrien sikkert selv sikre.
Teknologien kræver i sin grundsubstans ikke anskaffelse af meget og dyrt apparatur (Ran 2013b).
7. Kontaktperson
Klaus Rieneck, Rigshospitalet afd 2034, Blegdamsvej 9, 2100 København Ø, email: kr@rh.dk
Referencer
1. http://www.etiskraad.dk/etiske-temaer/genteknologi/undervisning-til-gymnasieskolen/genteknologi/sygdomsbehandling
2. David Baltimore, Paul Berg, Michael Botchan, Dana Carroll, R. Alta Charo, George Church, Jacob E. Corn, George Q. Daley,Jennifer A. Doudna, Marsha Fenner,Henry T. Greely, Martin Jinek, G. Steven Martin, Edward Penhoet, Jennifer Puck, Samuel H. Sternberg, Jonathan S. Weissman, Keith R. Yamamoto, A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification. Science 03 Apr 2015:Vol. 348, Issue 6230, pp. 36-38
3. Bhaya D, Davison M, Barrangou R. 2011. CRISPR Cas systems in bacteria and archea: Versatile Small RNAs for Adaptive Defense and Regulation. Annu. Rev. Genet. 45:273–97.
4. Chandrakasan S, Malik P. 2014. Gene therapy for hemoglobinopathies: the state of the field and the future. Hematol Oncol Clin North Am. Apr;28(2):199-216.
5. Genovese P, Schiroli G, Escobar G, Di Tomaso T, Firrito C, Calabria A, Moi D, Mazzieri R, Bonini C, Holmes MC, Gregory PD, van der Burg M, Gentner B, Montini E, Lombardo A, Naldini L. 2014. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature 510; 235-240.
6. Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. 2014. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat Biotechnol. Jun;32(6):577-82.
7. Ran FA, Hsu PD, Lin CY, Gootenberg JS, Konermann S, Trevino AE, Scott DA, Inoue A, Matoba S, Zhang Y, Zhang F. 2013a. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154, 1380–1389.
8. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. 2013b, Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols vol 8, no 11, 2281-2308.
9. Suzuki K, Yu C, Qu J, Li M, Yao X, Yuan T, Goebl A, Tang S, Ren R, Aizawa E, Zhang F, Xu X, Soligalla RD, Chen F, Kim J, Kim NY, Liao HK, Benner C, Esteban CR, Jin Y, Liu GH, Li Y, Izpisua Belmonte JC. 2014. Targeted Gene Correction Minimally Impacts Whole-Genome Mutational Load in Human-Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cell Clones. Cell Stem Cell Volume 15, Issue 1, 3 July, Pages 31–36
10. Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, Goodwin MJ, Aryee MJ, Joung JK. 2014. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. Jun;32(6):569-76.
11. Veres A, Gosis BS, Ding Q, Collins R, Ragavendran A, Brand H, Erdin S, Talkowski ME, Musunuru K. 2014. Low Incidence of Off-Target Mutations in Individual CRISPR-Cas9 and TALEN Targeted Human Stem Cell Clones Detected by Whole-Genome Sequencing. Cell Stem Cell, Volume 15, Issue 1, 3 July, Pages 27–30
12. Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA 2012. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331-338.
13. Xie F, Ye L, Chang JC, Beyer AI, Wang J, Muench MO, Kan YW. 2014. Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Res. Sep;24(9):1526-33. doi: 10.1101/gr.173427.114. Epub 2014 Aug 5.
14. Yin H, Xue W, Chen S, Bogorad RL, Benedetti E, Grompe M, Koteliansky V, Sharp PA, Jacks T, Anderson DG. 2014. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. Jun;32(6):551-3.